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孙文博,章志强,李庆,等.过硫酸氢钾复合盐粉对水产病原菌的杀灭效果[J].水产养殖,2024,45(1):33-36+62.

细菌性疾病一直是制约水产养殖业发展的重要因素[1]，不仅导致水产动物大量死亡，还会引发病毒性疾病暴发，对水产养殖业造成巨大威胁[2]。控制水产养殖环境中病原菌的数量对于水产动物疫病防控至关重要。目前，水产动物病害防控的关键技术体系包括病原检测、微生态制剂施用、水产消毒剂、中草药和抗生素的应用[3]。其中，化学类消毒剂可以抑制或杀灭水体中的病原微生物，降低水体中病原菌的丰度，阻止细菌性疾病的传播和暴发方面发挥着重要作用[4]。由于成本较低且效果显著，化学类消毒剂目前在水产养殖中得到广泛应用。水产养殖中化学类消毒剂的使用缺乏科学指导，滥用消毒剂会给养殖水环境带来危机。因此，研发环境友好型的水产养殖消毒剂，并科学指导其应用，对于水产养殖业的发展具有重要意义。

过硫酸氢钾复合盐粉（2KHSO5·K2SO4·KHSO4，简称PMS），是一种由单过硫酸氢钾（KHSO5, PMPS）、硫酸氢钾（KHSO4）和硫酸钾（K2SO4）为主，辅以表面活性剂、无机酸和有机酸等组合而成的一种新型的过氧化物类消毒剂。PMS能够溶于水，分解产物为无害的无机盐，并在水体中产生高活性的自由基和活性氧等物质，通过氧化作用有效杀灭各种病原微生物。它具有广谱的杀菌作用、高安全性和环境友好等优点[5]。PMS还能降解养殖水体中的氨氮，提高溶解氧水平，促进污泥颗粒的分解，从而改善水质和底质的情况[6-7]。目前PMS已广泛应用于水产养殖、畜牧业、污水处理和医疗环境消毒等领域。然而关于PMS对水产养殖相关病原细菌的杀灭效果尚不明确，而且不同生产厂家的产品质量也存在差异，使得选择高质量产品变得困难。现选取水产养殖中常见的8种病原细菌为试验菌株，分析了PMS在不同浓度下的杀菌动力学参数，同时比较了某国产品牌和某进口品牌生产商生产PMS的杀菌效果，为实际生产中的合理使用及后续研究提供参考。

1 材料和方法

1.1时间与地点

2023年4—7月，试验地位于江苏省扬州大学动物科学与技术学院水产养殖实验室。

1.2材料

某国产品牌和某进口品牌生产商生产的PMS均为50%粉剂（含有50%的PMS）。维氏气单胞菌Aeromonas veronii (ATCC 35622)、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila (BNCC186123)、大肠埃希氏菌Escherichia coli (BNCC133264)、河流弧菌Vibrio fluvialis (BNCC337051)、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus (ATCC33787)、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus (BNCC138541)、鳗弧菌Vibrio anguillarum (BNCC354817)和杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida (CCTCC208068)，均为商品化的标准菌株。其中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希氏菌、河流弧菌、杀鱼爱德华氏菌和鳗弧菌使用LB液体培养基进行培养，副溶血弧菌使用2216E培养基进行培养。

1.3试验方法

1.3.1细菌培养及抑菌试验

经LB平板或2216E琼脂培养基活化后，挑选单克隆菌株，接种于200 mL相应液体培养基中，并将其放置于恒温摇床(28℃ / 37℃，180 r/min)中连续培养24 h以上，6 000 r/min离心5 min，收集菌体，并用无菌的PBS磷酸盐缓冲液洗涤2~3次，做成菌悬液待用。将50%国产的PMS粉剂溶解于无菌水中，并分别配置成1, 10, 50, 100和200 mg/L的浓度。将配置好的PMS溶液取10 µL加入到1mL稀释后的菌液中，稀释100倍，使得PMS的终浓度分别为0, 0.01, 0.10, 0.50, 1.00和2.00 mg/L。对细菌悬液计数，并进行稀释，确保菌悬液中细菌菌落数少于2×104 cfu/mL，以避免菌落数太多致无法准确计数。将不同浓度的PMS与菌液摇匀后，室温下静置处理，并分别在0.5，1.0，1.5 和2.0 h时，取100 µL混合液涂布在LB或2216E营养琼脂平板上，倒置放于28℃恒温培养箱培养24 h。培养结束后对平板上的菌落进行计数。

1.3.2 2种品牌的PMS杀菌效果比对试验

为了对比不同厂家的PMS产品杀菌效果，选用了某国产品牌和某进口品牌的PMS，其有效成分均占50%。将2种不同的PMS稀释至终浓度为0.5，1.0，10.0和50.0 mg/L。所选用的菌株与培养处理的方法同1.2，但仅在处理2 h时进行涂板计数，计算其杀菌效率。

1.3.3 PMS对降低鲫感染维氏气单胞菌的死亡率试验

为了进一步验证PMS对养殖水体病原细菌的杀灭作用，分析PMS对通过人工浸泡感染维氏气单胞菌鲫死亡率的影响。选择鲫体质量为（0.52 ± 0.18）g，体长（3.44 ± 0.37）cm。试验鱼暂养在5 L的透明的亚克力水槽中，连续曝气，控温在25℃，每个水槽中暂养30尾鲫，共6个水槽。感染试验分为2组，分别为对照组和试验组，每组3个重复。试验组和对照组的养殖水体中均添加过夜培养的维氏气单胞菌，浸泡感染的细菌浓度控制在106~107 cfu/mL。试验组每天往水体中添加PMS至2 mg/L，试验持续5 d，统计鲫的累计死亡率。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件作图，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用t检验和单因素方差分析2组间数据的差异性，试验组与对照组P < 0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PMS对不同病原菌的杀灭效果

探究了不同浓度的PMS在不同处理时间下对8种常见水产病原菌的杀灭效果，记录了各浓度和处理时间后的菌落数量。PMS对8种不同病原菌的杀灭效果见图1(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h)。由图1可见，PMS对常见菌的杀菌效果不具有特异性，呈现出类似的趋势。在相同浓度下，处理时间越长，菌落数量越少，杀菌效率越高。而在相同处理时间下，PMS的浓度越高，菌落数量越少，杀菌率越高。

 2.2 不同品牌PMS的杀菌效果对比

对某国产品牌和某进口品牌的PMS产品进行了杀菌效果评估，结果见图2(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h)。在高浓度（5 mg/L）下，这2种产品对所选的8种常见病原菌都表现出良好的杀菌活性，几乎能完全消灭该浓度下的病原菌。然而，在低浓度（0.5和1 mg/L）下，某国产品牌的PMS对维氏气单胞菌（A. veronii）、嗜水气单胞菌（A. hydrophila）、大肠杆菌（E. coli）、河流弧菌（V. fluvialis）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、杀鱼爱德华菌（E. piscicida）和副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）表现出更高效的杀菌活性。这一结果间接证明了不同厂家生产的PMS产品之间的差异性，而某国产品牌的产品则展现出更好的杀菌效果。

2.3 PMS降低鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率

采用累计生存曲线，统计了PMS对鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率，结果见图3（Control是对照组，PMS是试验组）。由图3可见，对照组鲫感染细菌后的存活率显著降低，经过5 d观察，累计存活率仅为43%。而试验组在水体中使用2 mg/L的PMS进行消杀，5 d后的累计存活率为76%。从累计存活率曲线可以清楚地观察到使用PMS处理养殖水体后，能够显著提高鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率。

图1   PMS对8种不同病原菌的杀灭效果分析

图2  2种PMS产品对8种不同病原菌的杀灭效果分析

图3  PMS对鲫感染维氏气单胞菌累计存活率

3 讨论

3.1 PMS在水产养殖中的强效杀菌机理及影响因素分析

PMS具有强大且有效的非氯氧化能力，已被广泛应用于畜禽和水产养殖的消毒剂和水质改良剂 [8-9]。作为化学类消毒剂，PMS的杀菌原理主要是利用其强氧化性，在直接与菌体或酶蛋白中的氨基、羧基、巯基等发生反应的过程中损伤细胞结构或抑制代谢功能，从而导致细菌死亡[10]。研究指出，PMS的消杀活性受养殖水体中有机物浓度、温度和pH值的影响[11]。除了杀灭细菌外，PMS还能氧化水体中的有机物，因此也会影响对病原细菌的消杀效果。因此，在评估PMS对病原菌的杀灭活性时，传统的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定方法不适用，需要采用类似于本试验中分析PMS复合盐粉对不同细菌的杀菌动力学参数的方法[12-13]。尽管本试验中PMS复合盐粉对不同病原菌的杀灭效率存在一定差异，但随着PMS浓度的增加和处理时间的延长，2 mg/L的PMS复合盐粉处理2 h，已经能够显著杀灭104 cfu/mL的病原细菌，表现出较强的杀菌效果。PMS的杀菌效果与浓度、处理时间以及初始菌体数量显著相关，但其对不同细菌的杀灭特异性则不明显。有研究[14]指出，10~60 mg/L的PMS复合盐粉，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌等不同病原微生物处理5 min，其杀灭率均>99%。1250 mg/L的PMS对溶血性链球菌和多杀性巴氏杆菌作用2.5 min，杀菌对数值>5[15]。PMS对黄颡鱼2种病原菌温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌的杀菌浓度分别在31.25和125.00 mg/L[16]。上述研究表明,PMS能够显著杀灭病原菌，而杀菌效果差异，主要与PMS的来源和检测方法有关。而本试验中，排除了培养基中蛋白胨和酵母粉等有机物的干扰，直接展示了PMS对病原菌的杀灭效果，其结果更能准确反映PMS对水产病原菌的直接杀灭活性。而本试验所选的8种病原菌均为水产常见致病菌，PMS对其杀灭效果的数据为水产养殖病害防控提供了更有效的参考依据。

3.2 PMS在水产养殖中的效果与安全性

目前市场上销售的PMS主要以过硫酸氢钾复合盐为主要成分，同时添加了络合剂、增效剂、稳定剂、表面活性剂、氯化钠、有机酸等辅料进行配制。由于不同厂家的配方、生产工艺和原材料等因素的差异，生产出的PMS产生的效果各不相同，质量莠不齐[17]。在本试验中，2种PMS产品在高浓度下对病原细菌的杀灭效果一致，但在低浓度下，国产某产品表现出更高的杀菌效率，这也证实了市面上PMS产品效果的差异性。同时，在毒理学方面的研究指出，1 kg体质量小鼠，急性经口毒性半数致死量（LD50）> 4207 mg[18]。在黄颡鱼毒性研究[19]中，PMS使用的安全浓度为8.5 mg/L。PMS对养殖动物的毒性研究相对较少。文献[20]指出，水体中投加PMS消毒后造成的遗传毒性显著低于次氯酸钠消毒，产生的卤代烃和卤代物生成较少，这也表明PMS用于消毒仍有一定的安全风险。而本试验中，PMS显著提高了鲫感染维氏气单胞菌后的累计存活率，并未表现出明显的药物毒性，这说明PMS是一种有效的预防和治疗水产细菌性疾病的药物。

综上所述，对于PMS的使用，需要进行科学指导，选择适当的产品，以达到预防和治疗水产细菌性疾病的目标。

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